剪切、複製、粘貼，消除不需要的基因片段，換上想要的基因片段，這就是基因組編輯技術，它猶如一把“基因剪刀”，被科學家應用在各種動植物的基因修複與(yu) 改造之中，為(wei) 醫學、健康、農(nong) 業(ye) 等方麵帶來了突破性的革命。

為(wei) 了更精準地實現基因組編輯，近年來，科學家不斷探索更多方法發展基因組編輯技術。

中國科學院遺傳(chuan) 與(yu) 發育生物學研究所研究員高彩霞團隊與(yu) 李家洋院士團隊合作開發了高效設計pegRNA以及提高植物引導編輯效率的新策略，為(wei) 實現植物基因組功能解析和作物精準育種提供了強有力的技術支撐。相關(guan) 研究成果於(yu) 3月25日淩晨在線發表於(yu) 《自然—生物技術》。

更精準的“夢想”

2019年10月，哈佛大學教授劉如謙（David Liu）團隊開發了全新的基因組引導編輯技術（Prime Editing），該技術能夠在基因組的靶位點處實現精準的片段插入、刪除及堿基的任意替換，被稱為(wei) 是“超越CRISPR”的重大突破。

引導編輯係統由兩(liang) 部分構成：其一，是nCas9 (H840A)與(yu) 工程化改造的逆轉錄酶（Reverse Transcriptase, RT）組成的融合蛋白；其二是包含PBS（Primer Binding Site）序列和RT模板（RT template）序列的pegRNA（Prime Editing Guide RNA）。

2020年，高彩霞團隊擴展了引導編輯技術的應用，首次在水稻和小麥中成功建立並優(you) 化了適用於(yu) 植物的引導編輯器（Plant Prime Editor, PPE），為(wei) 實現農(nong) 作物精準基因組編輯提供了技術支撐。

“目前版本的引導編輯器在植物中的工作效率依舊偏低，需要進一步優(you) 化。”高彩霞研究員告訴《中國科學報》，“我們(men) 之前的研究發現植物的引導編輯效率很大程度上受到PBS序列和RT模板序列的影響，這暗示著，對pegRNA序列進行合理設計對提高引導編輯效率有很大幫助。”

兩(liang) 種新策略

如何提升引導編輯效率並快速獲取高效形式的pegRNA，是植物引導編輯技術亟需解決(jue) 的問題。

一開始，研究人員設計實驗篩選高效形式的pegRNA，並希望能找到一般性的規律， 然而，事與(yu) 願違。常規實驗方法費時費力，限製了引導編輯技術在植物中的應用。

研究人員另辟新路。

由於(yu) 引導編輯係統的PBS序列與(yu) 非靶標鏈結合是起始逆轉錄過程的重要條件，而熔解溫度（Melting Tempreture, Tm）決(jue) 定了兩(liang) 條鏈結合的緊密程度，因此，他們(men) 推測PBS的Tm值很有可能對引導係統的編輯效率有重要影響。

為(wei) 驗證推測正確與(yu) 否，研究人員在18個(ge) 內(nei) 源位點進行了測試，結果表明，當PBS的Tm值為(wei) 30℃左右時，引導編輯效率在多數水稻內(nei) 源位點上達到最高，並且隨著溫度的增高或降低均呈現遞減的趨勢。這也驗證了他們(men) 的猜想。

研究人員還設想，對一個(ge) DNA位點的正鏈和負鏈都各設計一個(ge) pegRNA，利用DNA兩(liang) 條鏈之間存在反向互補序列，是否可能會(hui) 同時“啟動”細胞中的其它修複途徑，共同提高引導編輯係統的編輯效率。

他們(men) 在15個(ge) 水稻內(nei) 源位點測試了該策略，結果表明，該策略與(yu) 分別遞送單個(ge) pegRNA的方法相比效率平均可以提升3.0倍。他們(men) 將該改進策略命名為(wei) “雙pegRNA策略”。

另外，實驗還表明，運用SpG變體(ti) 可以進一步拓展雙pegRNA策略的編輯範圍。

建立新平台

國際同行專(zhuan) 家給出了高度評價(jia) ，“鑒於(yu) 引導編輯技術的迅猛發展，該工作將對基因組編輯領域內(nei) 產(chan) 生很大影響。”

“pegRNA的設計相對複雜，如何建立一個(ge) 平台，幫助需要科研人員針對所需位點進行合理的設計，幫助他們(men) 構建高效的引導編輯策略，方便大家使用。在這方麵李家洋老師團隊非常有經驗。”高彩霞說。

為(wei) 此，基於(yu) 上述兩(liang) 個(ge) 策略，研究人員開發了植物pegRNA設計網站PlantPegDesigner（https://www.plantgenomeediting.net/）。

該網站可以提供一係列的參數供使用者根據需要進行個(ge) 性化選擇，並可以推薦完整的pegRNA選擇、設計與(yu) 構建方案，方便使用者快速篩選高活性pegRNA。實驗結果表明，與(yu) 常規設計方案或其他pegRNA設計網站相比，該網站設計的pegRNA具有更高的編輯效率。

實現重要農(nong) 作物精準基因組編輯對加快農(nong) 作物遺傳(chuan) 改良進程具有重要意義(yi) 。下一步，研究團隊將繼續優(you) 化策略，提升網站平台，為(wei) 作物品種改良等提供更高效精準的新工具。

相關(guan) 論文信息：https://doi.org/10.1038/s41587-021-00868-w

圖：植物高效引導編輯設計策略。（a,b）PBS的Tm值指導pegRNA設計的示意圖及其對PPE在水稻中編輯效率的影響。（c,d）雙pegRNA策略的示意圖及其對PPE編輯效率的提升。（e）PlantPegDesigner在線設計網站的工作流程。（課題組供圖）



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