趙方慶（左二）與(yu) 團隊成員查看測序數據情況。課題組供圖

■本報記者 唐鳳

實際上，核糖核酸（RNA）不總是“一條線”，這種遺傳(chuan) 信息載體(ti) 也會(hui) 是一個(ge) 圈。環形RNA則是一類非常特殊的RNA分子。大量研究表明，它在腫瘤發生和天然免疫過程中發揮著重要的調控作用，但人們(men) 一直缺乏對其進行有效測定的手段。

近日，中科院北京生命科學研究院趙方慶團隊提出了基於(yu) 三代納米孔測序技術對環形RNA全長直接測定的實驗和分析流程——CIRI-long。相關(guan) 論文刊登於(yu) 《自然—生物技術》。研究人員利用隨機引物對環形RNA進行的滾環反轉錄擴增後，使用納米孔測序技術對環形RNA的全長序列進行直接測序，並實現了對長測序讀段中的環形RNA序列進行識別和全長重構。

中科院上海營養(yang) 與(yu) 健康研究所研究員楊力和博士馬旭凱認為(wei) ，該研究為(wei) 深入探索複雜的環形RNA生成加工奠定了基礎。

獲得整張圖的全貌

環形RNA廣泛存在於(yu) 真核生物中。目前研究表明，在生物體(ti) 內(nei) ，環形RNA主要通過其序列特征，發揮miRNA海綿、RBP海綿以及翻譯短肽等重要的生物學功能。

由於(yu) 具有首尾相連的環形結構，環形RNA在細胞中結構更穩定，也存在更強的積累效應。因此，科學家可以利用人工設計的環形RNA分子，在細胞中穩定表達目標蛋白。同時，環形RNA在腫瘤生物標記物和作為(wei) 治療靶點等多個(ge) 方麵具有重要的應用前景。

但因為(wei) 環形RNA序列本身和普通線性RNA高度相似，常用的二代轉錄組測序技術往往難以獲得完整的環形RNA全長序列。

此前，趙方慶團隊的研究方向之一就是利用高通量測序技術對環形RNA進行識別。“通過多年研究，我們(men) 深切體(ti) 會(hui) 到了傳(chuan) 統二代測序技術對於(yu) 環形RNA研究的局限性。”趙方慶告訴《中國科學報》。

隨著新一代測序技術的發展，基於(yu) 納米孔的長讀長測序技術已經在很多領域得到廣泛應用。這種測序方法可以一次測定非常長的序列，由此研究人員想到，可否使用該技術研究環形RNA分子結構。

“從(cong) 測序數據中區分環形RNA和線性RNA，類似於(yu) 同時拚兩(liang) 幅隻有幾塊不一樣的拚圖。”論文第一作者張金陽告訴《中國科學報》，“由於(yu) 兩(liang) 者很相似，隻有接頭位點具有特異性結構，因此利用短讀長測序技術，很難區別這些‘小塊’源於(yu) 線性還是環形分子。利用長讀長技術則可以一次獲得整張圖的全貌，簡便地實現對環形RNA序列的直接鑒定。”

效率提高20倍

研究人員通過大量實驗，優(you) 化了環形RNA的富集方法，利用滾環反轉錄的方式，獲得了含有多個(ge) 環形RNA全長序列的cDNA片段。他們(men) 利用超長讀長技術，對環形RNA的全長序列進行了直接測定。研究人員還開發了相應的計算軟件，在測序數據中對環形RNA的全長序列進行識別和錯誤校正。

通過比較，研究人員發現，改進後的方法可以有效富集環形RNA序列，對環形RNA的檢測效率提升了近20倍。同時，CIRI-long大幅增強了環形RNA的識別能力，對長度較長的環形RNA也可以進行有效識別。

趙方慶提到，評估顯示CIRI-long可靠性高，且可以識別來自線粒體(ti) 基因組以及轉錄本通讀事件的環形RNA分子，並實現與(yu) 二代測序相近的分析成本。

近期多個(ge) 研究也發現，線粒體(ti) 中可以產(chan) 生大量環形RNA分子，並且可能具有調節線粒體(ti) 活性氧輸出的重要功能。因此科學家利用CIRI-long方法，可以有效識別這類特殊環形RNA分子，並為(wei) 其存在提供進一步的證據。

隨後，研究人員利用新方法對小鼠大腦組織中的環形RNA進行了深入研究，並發現了一類新型環形RNA分子。這類分子由內(nei) 含子的全長序列首尾相接組成，具有特殊的剪接信號，可能代表著一種未發現的環形RNA產(chan) 生途徑。

線性、環形RNA有待“一網打盡”

總的來說，該方法建立了針對環形RNA全長的高效識別手段，為(wei) 環形RNA的功能挖掘提供了重要的研究平台和工具。利用該方法，研究人員可以對環形RNA的全長進行大規模測定，並基於(yu) 全長序列進行功能預測，也為(wei) 設計環形RNA治療靶點提供了重要的研究工具。

複旦大學的張朝以及美國得克薩斯農(nong) 工大學的韓冷認為(wei) ，研究結果凸顯了該方法在鑒定環形RNA和探索環形RNA形成機製等方麵的重要意義(yi) 。值得注意的是，費城兒(er) 童醫院的邢毅團隊近期開發的isoCirc也實現了基於(yu) 三代測序對環形RNA全長的高效重構。這些方法提升了環形RNA的檢測效率，並能有效重構環形RNA的全長結構，為(wei) 後續研究環形RNA的功能機製及轉化應用等打下了堅實基礎。

不過，CIRI-long方法仍有一定局限性。由於(yu) 環形RNA在生物體(ti) 內(nei) 含量很低，在目前研究過程中，研究人員采用多步實驗手段針對環形RNA進行富集。因此，該方法隻能實現對環形RNA的高靈敏度檢測，無法開展對線性RNA和環形RNA的同時研究。因此，未來仍需對環形RNA測序作進一步改進。

接下來，趙方慶團隊將繼續研究長讀長測序技術在環形RNA研究中的應用，結合實驗技術與(yu) 計算方法，對環形RNA的生物學功能和應用進行深入挖掘。

相關(guan) 論文信息：https://dx.doi.org/10.1038/s41587-021-00842-6