狼山雞體(ti) 細胞“克隆”後代中出現羽色表型相似的個(ge) 體(ti) 。揚州大學供圖

■本報記者 李晨 通訊員 虞璐

自1997年“多莉”克隆羊問世以來，已經有20多種哺乳動物相繼實現了體(ti) 細胞克隆的無性繁殖。然而，由於(yu) 特殊的卵生生殖模式，體(ti) 細胞克隆方法無法在禽類動物中使用，因此禽類動物的保種、挽救、瀕危複原和生物工程育種等工作遇到了瓶頸，且一直未被突破。

近日，《自然—通訊》雜誌在線發表了揚州大學動物科學與(yu) 技術學院教授李碧春和陳國宏研究團隊的最新研究文章。該文章介紹了將雞體(ti) 細胞（成纖維細胞）逆轉為(wei) 原始生殖細胞繁殖後代的理論研究和方法體(ti) 係。

破解禽類動物體(ti) 細胞克隆難題

文章共同通訊作者陳國宏告訴《中國科學報》，哺乳動物體(ti) 細胞克隆技術的原理是將重編程的體(ti) 細胞移植到去核的卵母細胞中，形成重構胚胎，然後移植入代孕母體(ti) 中繼續發育，產(chan) 生出克隆動物，例如克隆羊“多莉”。

“但這一技術無法在禽類動物上實施。”文章共同通訊作者李碧春說。主要原因是，“禽類受精卵（蛋）排出時已經發育到具有大量細胞的晚期囊胚階段，且和卵黃密切相連吸取營養(yang) 。”

團隊成員左其生介紹，禽蛋中除了卵母細胞（未受精卵）或早期胚胎（受精卵）外，還含有大量胚胎發育需要的營養(yang) 物質（卵黃）；加之，禽類卵母細胞的核大且隻被薄薄的一層細胞質包裹，這使得去除和移入細胞核這個(ge) 過程很難實施。

如果沿用哺乳動物體(ti) 細胞核移植方式，將重構胚胎植入雞蛋中，就相當於(yu) 把已經“著床”在子宮裏的胚胎去掉，再換上重構胚胎繼續發育。

“這個(ge) 過程目前在卵生動物上不可能實現。”文章作者張亞(ya) 妮表示，“這就使得禽類動物的克隆遇到了難以逾越的問題，這一瓶頸阻礙了禽類遺傳(chuan) 學、發育生物學和家禽業(ye) 生物工程育種、種質資源保存與(yu) 瀕危禽類恢複，以及遺傳(chuan) 分子機製等領域的研究工作進展。”

目前我國擁有非常豐(feng) 富的畜禽品種資源。陳國宏認為(wei) ，做好畜禽品種資源的保護是將來優(you) 良性狀利用和生物工程育種的基礎，挖掘和建立合適的保種體(ti) 係就顯得尤為(wei) 必要。

在哺乳動物中，無論是體(ti) 細胞克隆技術，還是配子和胚胎凍存技術都可以有效地保護當下的品種資源。但是在禽類動物上，這些方法並不完全適用，因此需要開辟新的方法。

“我們(men) 的研究利用了雞原始生殖細胞隨血液遷移的特點，首先將供體(ti) 細胞，即成纖維細胞，在體(ti) 外轉分化為(wei) 原始生殖細胞，再異體(ti) 移植到受體(ti) 中，使其借用受體(ti) 性腺的環境發育成精子或卵子，待受體(ti) 雞性成熟後相互交配，產(chan) 生來源於(yu) 供體(ti) 雞的後代。由於(yu) 與(yu) 哺乳動物體(ti) 細胞克隆有不同之處，因此我們(men) 稱其為(wei) 類克隆雞。”李碧春說。

“類克隆雞的產(chan) 生，不僅(jin) 能為(wei) 禽類動物的種質資源保護和瀕危禽類的恢複提供一種新方法，而且為(wei) 未來禽類動物的生物工程育種、性狀遺傳(chuan) 機製解析等基礎研究工作提供新途徑。”陳國宏說。

實現體(ti) 細胞高效逆轉為(wei) 原始生殖細胞

該團隊2010年就啟動了類克隆雞的研究工作。隨著對雞原始生殖細胞生物特性研究的不斷深入，他們(men) 發現，雞原始生殖細胞可作為(wei) 工具細胞進行類克隆雞的生產(chan) ，但遇到了如何大量獲取原始生殖細胞的難題。

雖然在哺乳動物中已經建立了高效的體(ti) 外誘導原始生殖細胞的方法體(ti) 係，但在禽類動物上該方法體(ti) 係尚未建立。

左其生介紹，該團隊前期已建立了原始生殖細胞遷移歸巢並生產(chan) 後代雞的模型，為(wei) 雞的種質資源保護和恢複提供了新思路。

但由於(yu) 分離雞體(ti) 內(nei) 來源的原始生殖細胞數量少，且需以犧牲早期胚胎為(wei) 代價(jia) ，因此該團隊一直探尋能夠獲得大量原始生殖細胞的方法體(ti) 係。

他們(men) 先建立了胚胎幹細胞體(ti) 外誘導分化為(wei) 原始生殖細胞的體(ti) 係，但胚胎幹細胞也不容易獲得。“體(ti) 細胞重編程技術給我們(men) 的研究提供了一種很好的思路，體(ti) 細胞經過重編程能夠形成與(yu) 胚胎幹細胞類似的有分化潛能的誘導性多能幹細胞，且體(ti) 細胞的分離和冷凍技術相對容易，能夠在短時間內(nei) 大量獲取，對個(ge) 體(ti) 也不會(hui) 造成較大傷(shang) 害。”左其生說。

因此，他們(men) 選擇雞成纖維細胞，先將其重編程為(wei) 誘導性多能幹細胞，再進一步誘導分化為(wei) 原始生殖細胞，這樣就可以極大地解決(jue) 原始生殖細胞無法大量獲得且分離培養(yang) 困難的問題。

經過10多年的探索攻關(guan) ，該團隊將我國黑羽狼山雞的體(ti) 細胞逆轉成原始生殖細胞，並移植到隱性白羽白洛克受體(ti) 雞（代孕雞）體(ti) 內(nei) ，產(chan) 出了來源於(yu) 供體(ti) 黑羽狼山雞的後代。

體(ti) 細胞複原為(wei) 活禽成為(wei) 現實

“該技術是一項全新的將體(ti) 細胞複原為(wei) 活體(ti) 的方法，是一次改變禽類生物工程育種和種質資源保護傳(chuan) 統規則的創新，對家禽產(chan) 業(ye) 發展具有重要的實踐意義(yi) 。”一位文章評審專(zhuan) 家點評稱。

“這項研究可利用雞的體(ti) 細胞生產(chan) 後代，這一技術成為(wei) 生產(chan) 克隆雞的遊戲規則改變者，對雞肉研究領域非常有用。”另一位評審專(zhuan) 家評價(jia) 說。

經過探索，李碧春和陳國宏研究團隊還係統解析了雞體(ti) 細胞重編程和原始生殖細胞發生的調控機製，建立了高效的體(ti) 細胞重編程、誘導多能性幹細胞分化為(wei) 原始生殖細胞以及原始生殖細胞異體(ti) 移植的方法體(ti) 係。

“將這三項技術結合使用，成功地實現了將體(ti) 細胞複原為(wei) 活禽。這項工作突破了禽類遺傳(chuan) 工程操作困難的瓶頸，為(wei) 禽類動物的保護和瀕危品種的複原提供了理論依據和技術支持。將來結合基因編輯技術，可有效地獲得基因修飾後代，加快禽類動物的生物工程育種進程。”李碧春介紹。

目前，該團隊還建立了快速而有效的雞皮膚組織冷凍保存的技術體(ti) 係，且能從(cong) 解凍複蘇後的皮膚組織中獲得細胞並將其誘導成為(wei) 原始生殖細胞，為(wei) 禽類動物種質資源長期保存提供了技術支撐。

相關(guan) 論文信息：https://doi.org/10.1038/s41467-021-23242-5