■本報記者 韓揚眉

在真核細胞中，RNA可以“形單影隻”，也可以與(yu) 蛋白質“珠聯璧合”。後者被稱為(wei) RNA結合蛋白，擁有強大的基因調節能力。但RNA究竟與(yu) 哪些蛋白結合，將怎樣作用於(yu) 人類的發育、疾病？這都是懸而未決(jue) 的問題。

6月10日，中國科學院生物物理研究所研究員薛願超團隊與(yu) 合作者開發了可在微量細胞中鑒定RNA結合蛋白作用靶點的新技術LACE-seq，首次實現了在單堿基分辨率和單細胞層麵精準鑒定RNA結合蛋白的結合位點，為(wei) 研究RNA結合蛋白在胚胎發育和生殖疾病中的功能機製打開了大門。相關(guan) 成果發表於(yu) 《自然—細胞生物》。

尋覓工具

人類基因組共編碼了約1500個(ge) RNA結合蛋白，它們(men) 往往通過結合RNA分子上的特定基序或結構元件而調控細胞內(nei) 各種RNA分子的加工、定位、翻譯和穩定性等。

研究表明，RNA結合蛋白在早期生殖、個(ge) 體(ti) 發育、細胞分化、增殖和凋亡等幾乎所有的生理過程中都發揮了關(guan) 鍵的調控作用。同時，RNA結合蛋白的突變會(hui) 導致多種遺傳(chuan) 性疾病，比如肌肉萎縮性側(ce) 索硬化症、骨髓增生異常綜合征等。

因此，準確鑒定RNA結合蛋白的結合靶標及精確結合位置是理解其生理和病理調控機製的前提。

薛願超介紹，目前常用的鑒定RNA結合蛋白靶標的方法主要有RIP-seq和CLIP-seq。由於(yu) 這兩(liang) 種方法都依賴於(yu) 利用特異性抗體(ti) 富集RNA結合蛋白及其所結合的RNA，而且需要百萬(wan) 數量級的細胞，嚴(yan) 重限製了其在稀有細胞類型及臨(lin) 床穿刺樣本中的應用。

比如，由於(yu) 缺乏可在微量細胞甚至單細胞水平研究RNA結合蛋白靶標的實驗方法，導致人們(men) 仍不清楚早期生殖過程中RNA結合蛋白及其複合物的分子機製。

“當前針對RNA結合蛋白的相關(guan) 技術研究多是在幹細胞和體(ti) 細胞等可以在體(ti) 外大量擴增的細胞係中進行，而在早期生殖和臨(lin) 床穿刺等微量樣本中的研究依然是個(ge) 空白。”薛願超告訴《中國科學報》。

推開大門

曾經在華大基因從(cong) 事兩(liang) 年RNA相關(guan) 技術研發的蘇瑞寶加入薛願超團隊，成為(wei) 薛願超的第二位博士生，為(wei) 團隊開發LACE-seq方法奠定了基礎。

為(wei) 了建立這個(ge) 方法，蘇瑞寶認真細致地優(you) 化了每一個(ge) 實驗條件。在LACE-seq方法搭建完成之後，團隊重點研究了RNA結合蛋白Ago2/endo-siRNA沉默複合物在小鼠MII時期卵細胞中的作用靶標，解析了Ago2/endo-siRNA複合體(ti) 在卵細胞中調控mRNA翻譯以及抑製轉座子介導的嵌合體(ti) 轉錄本生成等一係列新機製和新規律。

在應用上，團隊利用創建的LACE-seq方法，首次在卵細胞中繪製了Ddx4、Ptbp1、Ago2和Mili等RNA結合蛋白的具體(ti) 靶標和結合位置，率先發現Ago2/endo-siRNA沉默複合物在卵細胞中以非完全互補配對的方式抑製mRNA的翻譯，並證明endo-siRNA的靶標Bub3、Chk1、Nuf2等的蛋白質水平變化可能與(yu) Ago2敲除後的表型相關(guan) 。

此外，他們(men) 還證明了Ago2/endo-siRNA複合物可切割由逆轉座子啟動子起始的嵌合體(ti) RNA，該機製確保了卵細胞中轉錄組的完整性。

LACE-seq技術具有實驗操作時間短、信噪比高、有效數據多、成本更加低廉等一係列優(you) 勢，克服了現有實驗方法的缺點，有效解決(jue) 了該領域的難題。這些優(you) 勢使得在珍稀的微量細胞如早期生殖細胞、癌症幹細胞、臨(lin) 床穿刺樣本中，研究RNA結合蛋白的調控、致病機理成為(wei) 了可能。

LACE-seq技術通過線性擴增逆轉錄酶在RNA結合蛋白結合位點處的終止信號，首次實現了在單堿基分辨率和單細胞層麵精準鑒定RNA結合蛋白的結合位點。

可以說，LACE-seq技術為(wei) 研究RNA結合蛋白及其複合物在早期生殖、胚胎發育等過程中調控基因表達的新規律打開了大門。

建立圖譜

RNA結合蛋白，英文簡稱RBP。據相關(guan) 研究，大約5%~10%的人類蛋白質可以與(yu) RNA結合。但到目前為(wei) 止，研究人員尚未對所有RNA結合蛋白進行普查，已知的RBP數量仍然是估計數。

RBP關(guan) 係人類基因奧秘，功能重要。建立起RBP“家族”圖譜，才能更有助於(yu) 挖掘一個(ge) 個(ge) “金礦”。

美國於(yu) 2013年啟動了一項大型研究計劃，準備利用增強型的紫外交聯和免疫共沉澱方法eCLIP來係統解碼RBP的調控機製，目前已經成功繪製了150個(ge) RBP的結合圖譜。不過，我國迄今還沒有相關(guan) 的RBP圖譜研究計劃。

“接下來，我們(men) 將與(yu) 國內(nei) 同行合作，希望快速推動LACE-seq方法的應用，尤其是在生殖及相關(guan) 疾病中的研究。同時我們(men) 希望建立全自動化LACE-seq平台，以大規模注釋RBP的功能機製，並發起有中國特色的RBP圖譜計劃。”薛願超說。

相關(guan) 論文信息：

https://doi.org/10.1038/s41556-021-00696-9