我們(men) 對大腦的研究是從(cong) 大腦各個(ge) 區域的精確區分開始。目前科學家已經對不同腦區的功能有了一定的了解，但還不夠詳實和細致。研究人員們(men) 早期主要利用解剖學特征對大腦區域進行區分。如今，隨著科研技術的進展，他們(men) 還可以利用遺傳(chuan) 學特性、腦區之間神經投射連接特性、行為(wei) 學功能特異性將腦區做進一步的細致劃分。

麵對大腦這個(ge) 最複雜多樣的器官，全世界的神經腦科學科研工作者們(men) 都在在做著愚公移山一樣的工作：通過每個(ge) 團隊的努力，試圖一點一點的將整個(ge) 大腦的功能進行完全解析。在眾(zhong) 多的研究中一個(ge) 非常樸素又十分重要的研究思路就是將原已確定劃分與(yu) 功能的某一腦區進行精確再細分。

接下來我們(men) 通過幾個(ge) 研究實例簡要介紹一下不同研究團隊都利用什麽(me) 樣的方法與(yu) 策略來將腦區進行進一步的細分。

圖源：fuzzylogix.com

腹內側下丘腦的腹外側：攻擊性行為的核心腦區再挖掘

在2017年Nature Neuroscience上發表的一文中，來自紐約大學的Dayu Lin研究團隊發現腹內(nei) 側(ce) 下丘腦的腹外側(ce) （VMHvl）的Esr1+神經元可以調控雌性小鼠的攻擊性行為(wei) 。

VMHvl在解剖學上結構本就已經很小，但是該研究團隊依然本著精益求精的科學態度，通過Nissl染色解剖形態學分析發現該區域中間存在一個(ge) 天然的“溝壑”（一個(ge) 長條狀缺少神經元胞體(ti) 區域）將該區域進一步劃分成內(nei) 側(ce) 和外側(ce) （VMHpvlm 和VMHpvll）。

通過免疫熒光染色也發現，Esr1+細胞主要分布在VMHpvll。通過行為(wei) 學誘導c-fos表達也發現，攻擊性行為(wei) 誘導c-fos主要表達在VMHpvlm，而交配行為(wei) 誘導c-fos主要表達在VMHpvll。

隨後，為(wei) 了進一步探究兩(liang) 個(ge) 區域轉錄組上的區別，該研究小組利用激光捕獲顯微切割對兩(liang) 個(ge) 區域進行了“極限操作”，將兩(liang) 塊區域分別切割下來進行了轉錄組測序，並且證實了不同基因轉錄水平上的差異。

這些數據都證實了VMHpvlm 和VMHpvll存在解剖上、分子上以及功能上的區別。在後續的下遊神經投射的分析中也發現，僅(jin) VMHpvll區域的神經元可以投射到前房室周圍核（anteroventral periventricular nucleus, AVPV）且該環路與(yu) 交配行為(wei) 密切相關(guan) ，而與(yu) 攻擊性行為(wei) 無關(guan) 。

然而該課題組並沒有停下對VMHvl腦區功能精細劃分的腳步。在2019年該課題組在Cell Report再次發文探究VMHvl不同區域在防禦行為(wei) （相對於(yu) 之前的攻擊性行為(wei) 研究）中的功能。

在上一個(ge) 研究中，研究人員探討的是同一冠狀切麵下該區域的內(nei) 側(ce) 與(yu) 外側(ce) 的區別。這一次，研究人員關(guan) 注的是在不同的冠狀切麵下該區域的區別，VMHvl被分為(wei) 前側(ce) 和後側(ce) （前側(ce) 更靠近嗅球，離Bregma點更近，分別為(wei) aVMHvl和pVMHvl）。

這次他們(men) 利用的依舊是不同行為(wei) 下c-fos的表達量的區別，對VMHvl範圍內(nei) 前後側(ce) 所有腦片進行染色技術分析發現，在小鼠進行防禦時aVMHvl區的c-fos表達量有明顯的升高，且被標記的神經元大部分為(wei) Ers1陽性的。接下來研究人員利用雙通道光纖記錄係統在同一隻小鼠中記錄aVMHvl和pVMHvl區域Ers1+神經元的活動性在社交行為(wei) 中的變化。

結果發現，在小鼠進行防禦行為(wei) 時，aVMHvl中Ers1+神經元活動性相比於(yu) pVMHvl有更顯著的升高。隨後，在環路的研究中也發現，aVMHvl和pVMHvl有著不同的投射模式。aVMHvl投射到更加靠後的腦區（如中腦導水管周圍灰質, PAG），而pVMHvl在投射模式中並沒有偏向性。

該課題組再次在各個(ge) 層麵證實了VMHvl腦區無論是在分子上還是功能上都需要被進一步的精確細分。筆者也十分佩服該課題組工作的嚴(yan) 謹與(yu) 細致。

但是兩(liang) 篇文章都沒有利用光遺傳(chuan) 學對細分的兩(liang) 個(ge) 區域分別標記再進行操控並觀察其對行為(wei) 的影響。筆者猜測主要是由於(yu) 細分後的兩(liang) 個(ge) 腦區並沒有產(chan) 生功能上的對立情況，且區別兩(liang) 個(ge) 腦區的功能差異也不是兩(liang) 篇文章想要論述的核心。而接下來要討論的這個(ge) 研究，則真正找到了一個(ge) 腦區中存在兩(liang) 個(ge) 功能各異的子區域。

丘腦室旁核前側後側在遺傳、解剖、和功能上的精確區分

該研究來自斯坦福大學Mario A. Penzo 課題組在2020年1月於(yu) Nature Neuroscience上發表的成果，發現PVT前側(ce) 後側(ce) 分布著從(cong) 解剖、遺傳(chuan) 特性、功能層麵都不同的兩(liang) 類神經元。

由於(yu) 在中央丘腦分布著豐(feng) 富的多巴胺D2受體(ti) （有Drd2基因表達的D2Rs），所以研究人員利用RNA原位雜交技術檢測PVT前側(ce) 後側(ce) （aPVT, pPVT）的Drd2的分布情況。發現pPVT中分布豐(feng) 富，而aPVT幾乎沒有Drd2。接下來作者利用艾倫(lun) 腦機構開源的小鼠腦連接組數據庫中檢索到若幹基因改造的Cre轉基因鼠用於(yu) PVT的神經元標記。

通過進一步比對發現，Gal基因選擇性的表達在aPVT中,而幾乎不表達在pPVT中。這就說明Gal-Cre轉基因鼠有可能作為(wei) 很好的工具來研究aPVT在行為(wei) 學中的功能。但是通過後續研究發現實際實驗中外源以Cre依賴的AAV並不能很好的表達。該研究小組隨後利用Cre-Off係統在Drd2-Cre中標記非Drd2陽性的細胞來操控aPVT的神經元。（實驗研究並不是一帆風順的，往往研究十之八九都是陰性結果，但是我們(men) 要有發現問題的嚴(yan) 謹的態度，麵對問題的勇氣和信心，解決(jue) 問題時靈活的思維）

在確定可以利用遺傳(chuan) 學手段分別標記aPVT和pPVT兩(liang) 類神經元之後，研究人員利用光纖記錄係統發現，兩(liang) 類神經元對積極/消極刺激反應不同:

• pPVT神經元活動性可以被消極刺激所激活，而被積極刺激所抑製；
• 與pPVT不同的是，無論是積極刺激還是消極刺激，aPVT II類神經元活動性都成下降狀態。

更進一步的，投射到PVT區域的前額皮層（mPFC）的aPVT中II類神經元對積極/消極刺激的反應是一致的，而反向激活mPFC-aPVT該通路可以抵消aPVT神經元的響應。

以前的研究證實PVT對不同效價(jia) 的刺激（積極刺激與(yu) 消極刺激）具有雙向調節的功能，這在pPVT中也得到了驗證。但是aPVT神經元活動性的變化說明aPVT的反應並不依賴刺激的效價(jia) 。為(wei) 此研究人員猜測aPVT可能與(yu) 小鼠狀態的變化相關(guan) 。狀態變化最為(wei) 明顯的實例則是清醒與(yu) 睡眠狀態的轉換。

為(wei) 了探究aPVT II類神經元活動性與(yu) 小鼠狀態（清醒或非快速動眼睡眠）的關(guan) 係，研究人員利用EEG記錄耦合光纖記錄係統記錄小鼠的活動狀態，研究人員發現：當小鼠從(cong) 非快速動眼睡眠到清醒狀態這一過程中，aPVT II類神經元活動性逐漸降低；反之，當小鼠從(cong) 清醒狀態進入到非快速動眼睡眠狀態。該類神經元活動性逐漸升高。化學遺傳(chuan) 激活此類神經元可以促進小鼠更多的進入非快速動眼睡眠階段。由此延伸，通過對小鼠瞳孔大小來監測小鼠狀態的變化發現，激活或者抑製mPFC-aPVT該通路可以雙向調控由尾部電擊導致的小鼠狀態的變化。

以上三篇文章我們(men) 可以看到兩(liang) 個(ge) 研究小組利用了免疫染色，行為(wei) 學耦合c-fos標記，RNA測序技術，光纖記錄技術、光遺傳(chuan) 學技術，對某一個(ge) 腦區進行了精確的再細分。我們(men) 可以注意到，這些腦區本身尺寸本身非常小，需要精湛的實驗操作技術，與(yu) 夯實的實驗數據結果，才能將腦區進行精細的劃分，撰寫(xie) 的文章才能受到同行評議的認可。

筆者原本打算引用在2019年5月於(yu) Science發表的一篇文章（DOI: 10.1126/science.aaw0474）再舉(ju) 一個(ge) 腦區精細化分的實例，但是令人感到驚訝的是，當筆者再次打開Science官網準備尋找該文獻的附錄時，發現這篇文章已經在2019年的12月被撤回了……我們(men) 可以在官網中看到撤回原因：文章的第一作者涉嫌行為(wei) 學數據造假。此舉(ju) 不禁令人感到錯愕。也希望每一位科研工作者都能對自己的數據負責。

參考文獻：

1.Hashikawa, K. et al. Esr1+ cells in the ventromedial hypothalamus control female aggression. Nat. Neurosci. 20, 1580–1590 (2017).

2.Wang, L. et al. Hypothalamic Control of Conspecific Self-Defense. Cell Rep. 26,1747–1758.e5 (2019).

3.Gao, C. et al. Two genetically, anatomically and functionally distinct cell types segregate across anteroposterior axis of paraventricular thalamus. Nat. Neurosci. (2020).


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