圖片來源：David Parkins

RNA分子在人體(ti) 中承擔著信使的角色。通過在細胞間進出，它能夠完成機體(ti) 組織間的信息交流。因此對科學家們(men) 而言，通過檢測RNA來診斷疾病似乎理所應當。他們(men) 認為(wei) ，通過檢測血液、唾液、尿液以及其它體(ti) 液中攜帶的RNA分子，就應該可以知曉檢測者的健康情況。

但現實情況卻複雜得多。“我們(men) 在這件事情上，都有點天真了。”加州大學聖迭戈分校（UCSD）的圍產(chan) 學家Louise Laurent表示。

Laurent致力於(yu) 開發微創性的RNA檢測技術，以用於(yu) 癌症、心髒病、神經退行性疾病以及其它疾病的早期篩查和臨(lin) 床管理。目前越來越多的科學家從(cong) 事這一領域，但胞外RNA（extracellular RNA, exRNA）的多樣性以及RNA運輸係統的複雜性，都給這一過程帶來了巨大的挑戰。“我覺得我們(men) 都低估了生物係統的複雜程度。”Laurent表示。她目前正在研究用exRNA來預測妊娠過程中的一些並發症。

RNA的多樣性會(hui) 導致檢測時存在大量的分子背景噪音，很難從(cong) 中辨別出具有臨(lin) 床意義(yi) 的生物標誌物。不僅(jin) 如此，由於(yu) 目前存在的技術難題都與(yu) exRNAs的收集、處理和分析有關(guan) ，因此不同實驗室的實驗結果間難以進行比較，而這種比較又恰恰是發現並驗證exRNA生物標誌物的必需步驟。

以分離胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）的方法為(wei) 例。胞外囊泡是由脂肪分子構成的膜狀結構，其大小一般為(wei) 人體(ti) 細胞的千分之一。它可以運輸RNA，並保護RNA不被體(ti) 液中的RNA酶降解。通過對囊泡相關(guan) 的約1700個(ge) 實驗進行分析，研究者們(men) 發現僅(jin) 從(cong) 體(ti) 液中提取囊泡的方法就超過了1000種1。這些方法的區別往往很小，比如用於(yu) 樣品離心的轉子型號等。但該項目研究者An Hendrix指出，“這些差別看似微小，但卻會(hui) 對提取的囊泡造成很大的影響。”An Hendrix同時也是比利時根特大學的一位研究胞外囊泡的癌症生物學家。

在過去五年中，exRNA診斷的相關(guan) 研究越來越多，與(yu) 之對應的是大學和公司都想要將這些成果轉化為(wei) 可應用的醫學技術。目前生物機製和實際應用兩(liang) 方麵均取得一定進展，因此科學家們(men) 開始探索RNA如何感知自身是否被包裹在囊泡或其它載體(ti) 中，以及RNA在不同生理或病理條件下發揮的作用。

另一方麵，得益於(yu) 諸如胞外RNA通訊聯盟（Extracellular RNA Communication Consortium, ERCC）這樣的相關(guan) 倡議，exRNA檢測的標準度和重複性正在不斷提高。該聯盟由美國國立衛生研究院（US National Institutes of Health, NIH）於(yu) 2013年發起，是一個(ge) 耗費1.6億(yi) 、跨度十年的項目，旨在促進基於(yu) exRNA的診斷和治療方法的臨(lin) 床研發工作。

盡管這些方法要應用於(yu) 臨(lin) 床實踐，還存在諸多困難，例如如何獲取高純度的囊泡等。但也有一些基於(yu) 體(ti) 液中exRNA的液體(ti) 活檢方法已經進入市場，可以為(wei) 癌症診斷結果不明的病人提供更多有用信息。以同樣的思路，可以針對其它疾病開發出對應的RNA分子探針。

Danilo Tagle是一位分子遺傳(chuan) 學家，同時也在NIH屬下的美國推進轉化科學中心（National Center for Advancing Translational Sciences）馬裏蘭(lan) 貝塞斯達分部工作。他是負責特殊項目的副總監，目前正在幫助ERCC進行協調組織工作。Tagle表示，“這個(ge) 行業(ye) 發展十分迅速，這推動著公司們(men) 將其中一些方法盡快商業(ye) 化。”

體(ti) 液檢測

在馬薩諸塞州沃爾瑟姆市的一個(ge) 實驗室裏，技術員們(men) 每月通常需要處理上千個(ge) 尿液樣本。他們(men) 需要從(cong) 每個(ge) 樣本中提取出所有的胞外囊泡，再從(cong) 囊泡中分離出RNA。

這就是Exosome Diagnostics公司的所在地。它是Bio-Techne的下屬公司，也是世界上第一家將基於(yu) 胞外囊泡的診斷方法應用於(yu) 臨(lin) 床實踐的公司。這個(ge) 方法被稱為(wei) ExoDx，它是專(zhuan) 門為(wei) 血液中前列腺特異性抗原（prostate-specific antigen, PSA）含量略微偏高的老年男性設計的，可以幫助他們(men) 確定是否需要對前列腺進行活體(ti) 組織檢查。

前列腺活檢需要將大頭針頭粗細的針插入到直腸中，然後吸取一小截組織。這個(ge) 過程非常痛苦，並且有可能會(hui) 出現出血、感染和膀胱相關(guan) 的後遺症。但如果不做前列腺活檢，則很難判斷血液中PSA含量為(wei) 2-10 ng/mL的這部分人群的健康狀況。他們(men) 有可能患有高度惡性腫瘤，需要盡快切除；但也有可能隻需要進行醫學觀察即可。根據目前的估計，處於(yu) 這個(ge) “灰色地帶”的人群中，含有惡性腫瘤的人數少於(yu) 25%。

ExoDx旨在讓更少的人經受活檢以及後續的過度醫療的折磨。它需要對尿液中的胞外囊泡裏含有的三種RNA分子進行量化檢測。其中兩(liang) 種分別與(yu) 原癌和抑癌基因有關(guan) ，另一種則與(yu) 前列腺癌發展所需的一個(ge) 非編碼RNA的基因有關(guan) 。通過檢測這些基因的相對活性，ExoDx可以預測檢測者患有惡性前列腺癌的可能性。

在兩(liang) 項臨(lin) 床試驗中，研究者對超過1000名PSA含量為(wei) 中等水平的男性進行了ExoDx檢測。結果表明ExoDx極為(wei) 準確地分辨出了其中可能患有癌症並需要進行活檢的人，以及病情較輕、可以繼續觀察的人。

圖源：pixabay

目前該公司正在積極開發其它臨(lin) 床領域的業(ye) 務。包括正在研發的第二個(ge) 基於(yu) 胞外囊泡的尿液檢測方法，它可以在術前預測腎移植受者對移植腎是否存在免疫排斥反應。另一個(ge) 正在研發的血液檢測，可以基於(yu) exRNA和循環腫瘤基因（circulating tumour DNA），檢測肺癌病人存在的基因突變。正如Exosome公司的聯合創始人和首席科學官Johan Skog所說，“這不僅(jin) 僅(jin) 是一種診斷方法，這是一個(ge) 平台。”

也有許多其它分子診斷公司和學術研究團隊想要將exRNA用以識別癌症的早期征兆或者輔助進行疾病的危險度分層。例如位於(yu) 加利福尼亞(ya) 州森尼韋爾市的Cepheid公司以及位於(yu) 新西蘭(lan) 達尼丁市的Pacific Edge公司，他們(men) 可以通過檢測尿液中五種編碼RNA的含量，篩查早期膀胱癌或者監測術後複發的預兆。該方法與(yu) Exosome的尿液檢測方法思路一致，都是通過收集腫瘤源附近的體(ti) 液，然後檢測其中癌症特異性的RNA分子。相同的方法也被用於(yu) 檢測脊髓液中腦癌相關(guan) 的RNA分子以及唾液中口腔癌相關(guan) 的RNA分子。但也有一些腫瘤會(hui) 將RNA分子擴散至全身。

對這些擴散至全身的RNA分子，大多數團隊都想在血液中進行檢測。但加州大學洛杉磯分校（University of California, Los Angeles）的口腔生物學家David Wong卻表示這些RNA在唾液中也能被檢測到。通過與(yu) 首爾三星醫學中心（Samsung Medical Center）的臨(lin) 床研究者合作，Wong對約2500名受試者的唾液進行了檢測。結果表明，唾液中含有的九種人體(ti) 或細菌來源的RNA，可以用於(yu) 預測檢測者患胃癌的可能性。後者是目前韓國最常見的癌症類型。

唾液檢測

如果我們(men) 的眼光不僅(jin) 僅(jin) 局限於(yu) 目前常用的體(ti) 液檢測的話，那麽(me) 除exRNA外的其它分子或許同樣可以用於(yu) 醫學診斷。正是基於(yu) 這樣的思路，位於(yu) 美國加利福尼亞(ya) 州南舊金山的Freenome公司正在嚐試采用多組學的方法。除了血液中的RNA之外，他們(men) 還將對蛋白質、DNA、表觀生物標誌物以及其它的疾病循環標誌物進行檢測。通過這樣的方法，他們(men) 希望能夠獲取癌症全方麵的生物特征，從(cong) 而解決(jue) 結腸癌早期篩查中存在的問題——目前用於(yu) 結腸癌早期篩查的腸鏡，由於(yu) 侵入性強、較為(wei) 痛苦，所以很多患者不願意進行檢測。

“我們(men) 需要盡可能地結合多種診斷方法，”Freenome公司的首席科學官Jimmy Lin表示。“單一的標誌物反映的信息不夠全麵”，因此很難通過一種物質來進行癌症診斷。

在今年的某個(ge) 會(hui) 議上，Freenome公司的科學家們(men) 介紹道，他們(men) 通過機器學習(xi) 算法搭建的平台，可以對大量的生物數據進行篩選，並最終選出其中超過90%的結腸癌病例。其預測性甚至好於(yu) 最近通過批準的一項糞便檢測方法，該方法也是目前腸鏡的唯一替代方法。

也有一些新興(xing) 的公司，嚐試將exRNA用於(yu) 心腦疾病領域。例如，馬薩諸塞州列克星敦市的Dyrnamix公司就正在研發一種可以為(wei) 心血管疾病患者提供個(ge) 性化療法的exRNA診斷技術。與(yu) 此同時，離納蒂克不遠的Neurodex公司，正在嚐試從(cong) 血液中分離神經元產(chan) 生的外泌體(ti) ，並提取其中的RNA和蛋白質進行檢測，希望能夠找到阿爾茨海默病的早期標誌物。

Johan Skog正在馬薩諸塞州沃爾瑟姆的Exosome公司中處理樣本。

圖片來源：Johan Skog，Exome Diagnostics

Neurodex的首席科學官、神經學家Erez Eitan表示，“總的說來，研究神經的人不太喜歡RNA。”他解釋道，與(yu) 癌症不同，神經疾病的病理學特征不在DNA或RNA層麵，而主要在蛋白質層麵。所以研究者們(men) 對RNA在神經退行中的作用知之甚少。

這部分解釋了為(wei) 什麽(me) 用於(yu) 阿爾茨海默病前期診斷的大多血液檢測方法，都是測量澱粉樣蛋白、活化tau蛋白以及其它在大腦中積累並造成這種疾病的蛋白。但這就像是通過翻找一個(ge) 人的垃圾桶，來判斷他的生活方式，Victoria Risbrough表示。Risbrough是一名神經學家，在美國退伍軍(jun) 人事務部（Veterans Affairs）屬下的應激與(yu) 心理健康卓越中心（Center of Excellence for Stress and Mental Health）工作。她認為(wei) 要了解這些疾病，更好的方法是通過相關(guan) 細胞間的信息交流方式，而這恰恰是exRNA的功能。

“RNA可以讓你知道什麽(me) 是造成病理現象的可能原因。”Risbrough表示。目前她正在與(yu) 加州大學聖迭戈分校的神經病理學家Robert Rissman合作，共同開發一項用於(yu) 創傷(shang) 性腦損傷(shang) 的診斷方法。“我們(men) 不是翻找垃圾桶，而是直接看它們(men) 之間交流的信息。”

附加價(jia) 值

盡管開發出一種能對腦部疾病進行全麵篩查的檢測方法，仍然是最終的目標。但新澤西州蒙默斯匯合站的DiamiR公司共同創始人和董事長Kira Sheinerman表示，對實驗性療法進行臨(lin) 床試驗的醫藥公司可能會(hui) 成為(wei) 大多數exRNA診斷的首批客戶。

DiamiR公司在血液中找到了炎症相關(guan) 的microRNA，並且該RNA分子在大腦中含量較高。通過檢測microRNA的含量，他們(men) 可以預測目前沒有認知障礙的老人，在未來是否會(hui) 罹患阿爾茨海默病，其準確度可達到84%。Sheinerman表示，藥物開發者和臨(lin) 床研究者可以利用該檢測，來辨別出處於(yu) 阿爾茨海默病前期的患者，並邀請他們(men) 作為(wei) 正在評估的實驗性療法的誌願者。

另一方麵，即使這些exRNA檢測最終沒有被廣泛使用，“它們(men) 仍然可以幫助我們(men) 對疾病建立新的假設。”神經學家Jeseph Quinn表示，他目前在位於(yu) 波特蘭(lan) 的俄勒岡(gang) 健康與(yu) 科學大學（Oregon Health and Science University）工作。Quinn與(yu) 分子神經生物學家Julie Saugstad合作，發現了一係列可用於(yu) 診斷阿爾茨海默病的microRNA。這些RNA分子可以作為(wei) 新的分子靶點，用於(yu) 新藥的研發。但同時Quinn也表示，其發揮作用的具體(ti) 生物機製仍未被闡明。因此，和大多數的研究者一樣，他們(men) 對exRNA診斷的研究仍然處於(yu) 初期探索階段。

目前該領域的研究問題之一，就是如何更好地分離胞外囊泡。盡管一些研究者已經可以不經胞外囊泡，直接獲得exRNA，但這種方法常常會(hui) 在分析RNA時，遺失一些細節。因此，研究者們(men) 正在逐漸拋棄對人體(ti) 體(ti) 液進行全RNA測序的方法，而更傾(qing) 向於(yu) 對目標器官分泌的囊泡中的RNA進行精準分析。“這種方法可以直接鎖定信息來源。”Dyrnamix公司共同創始人，也是波士頓馬薩諸塞州總醫院（Massachusetts General Hospital）的心髒電生物學家Saumya Das表示。

由於(yu) 不同分子在尺寸和密度上都有差異，所以科學家們(men) 通常會(hui) 通過離心來分離得到胞外囊泡。但這個(ge) 方法也存在缺陷。“在離心時會(hui) 有一些汙染，所以我們(men) 不能通過離心獲得100%純度的囊泡。”荷蘭(lan) 烏(wu) 得勒支大學（Utrecht University）的免疫細胞學家Esther Nolte-’t Hoen表示。

目前研究者們(men) 正在開發分離胞外囊泡的新方法。例如通過大小不同的小孔過濾得到囊泡，或者利用親(qin) 和性物質，結合樣品中的囊泡以實現分離。但無論是哪種方法，都需要一種標準參照物來進行校準，而這最近才得以實現。

去年，根特大學的Hendrix和她的同事研發出了一種可追蹤的工程化胞外囊泡。將其注射進體(ti) 液中，並進行追蹤，就可以驗證樣品製備和分析方法的準確性4。“長期以來，這個(ge) 領域都在尋找這樣一個(ge) 標準參照物。”Hendrix表示。她將這種可追蹤的囊泡分享給了許多實驗室，“每次我參加會(hui) 議，展示這一技術時，都有許多人請求我分享這一技術。

Hendrix、Nolte-’t Hoen以及其他研究者都積極地參與(yu) 到社區建設和數據記錄的相關(guan) 倡議中，以確保疾病診斷等關(guan) 於(yu) 含有RNA的胞外囊泡的研究，可以被恰當地詮釋和重複。“這或許不是科學意義(yi) 上最令人興(xing) 奮的那些事，但卻是必不可少的一部分。”Nolte-’t Hoen表示。

同時，NIH通過其數億(yi) 美元的項目，正在尋找更好的分離特定的胞外囊泡並分析其中RNA分子的方法。目前正在研發的exRNA診斷中很少能達到這個(ge) 精確度，甚至其中大部分都不需要對胞外囊泡進行提純，這種純度對臨(lin) 床應用來說是可以接受的。

但Tagle表示，“為(wei) 了說明研究的嚴(yan) 謹性，科學家需要知道為(wei) 什麽(me) 會(hui) 出現這樣的結果。這就會(hui) 讓研究者更加注重實驗過程，從(cong) 而產(chan) 生更可靠和可重複的結果。”

作者：Elie Dolgin是馬薩諸塞州薩默維爾市的一名科學記者。

翻譯：洪藝瑞

審校：潘燕婷

引進來源：科學美國人

引進鏈接：https://www.scientificamerican.com/custom-media/nature-outlook-extracellular-rna/could-tracking-rna-in-body-fluids-reveal-disease/


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